В 1837 году, в возрасте 63 лет, основательница монастыря и его первая игумения, матушка Евгения, скончалась и была погребена в монастырском Троицком храме возле придела святых благоверных князей Бориса и Глеба. Настоятельницей обители стала ее крестница и воспитанница, сестра Анастасия, прежде бывшая крепостной княгини Мещерской, служанкой ее дочери Анастасии. Сопребывание с игуменией Евгенией, при которой она была довольно долго казначеей, образовало ее, и так как она благоговела перед памятью покойной настоятельницы, то старалась о том, чтобы поддержать заведенный ею порядок, и ее игуменство было продолжением предыдущего. Она управляла Аносиным монастырем в течение двадцати лет (до перевода в Серпуховской Владычный монастырь).
Во время ее игуменства поступила в монастырь и постриглась в монахини внучка основательницы обители Евдокия (в монашестве Евгения) Озерова, ставшая третьей настоятельницей монастыря (1854–1875). Как и ее бабушка, в сан игумении новая настоятельница была возведена митрополитом Московским Филаретом. Прежде принятия должности настоятельницы, Евдокия Семеновна, нисколько не кичась своим происхождением и родством с матушкой-основательницей, в течение 5 лет со смирением и любовью проходила все послушания: носила воду и дрова на поварню, стирала белье, готовила пищу для трапезы сестер, мыла полы, сама закладывала лошадь.
Под руководством игумении Евгении-младшей Аносин монастырь успешно благоустраивался и к семидесятым годам прошлого века стал образцовой общежительной пустынью как по укладу жизни, так и по духовным своим достижениям. Обитель славилась прежде всего своим подвижничеством. Ее монахини нередко становились настоятельницами других монастырей и общин. Не случайно портрет Аносинской игумении Евгении украшал настоятельский корпус Оптиной пустыни – оптинские старцы часто направляли своих духовных дочерей в Аносину пустынь, зная, что именно там они получат помощь в монашеском подвиге и духовное окормление. Вообще Аносинский монастырь часто называли «женской Оптиной пустынью»: здесь также было развито старчество – традиция духовного окормления монашествующих, особенно новоначальных сестер. Каждая из них вручалась опытной монахине – старице, и отношения между ними строились на взаимном доверии, без чего невозможно стяжать смирение и послушание – начало всех других христианских добродетелей.
В 1875 году мать Евгению перевели в Москву, где до своей кончины в 1890 году она была настоятельницей московского Страстного монастыря. А настоятельницей Аносина монастыря после нее сталамонахиня Рафаила (Ровинская), единодушно избранная сестрами и утвержденная епархиальным начальством. Игумения Рафаила была достойной преемницей игумении Евгении в 1875–1879 годах; после Аносиной обители она управляла еще рядом монастырей Московской епархии.
Пятая игумения матушка Иоанна (Макарова) стояла во главе монастыря около сорока лет (1879–1918-1919?) и преставилась в возрасте 90 лет уже после революции (пришла в обитель матушка еще 18-тилетней девушкой). Она была строгой подвижницей, не принимала никаких личных услуг, сама делала все в своей келлии: убирала, топила, ставила самовар, отдельного стола не имела, а пользовалась общим, сестринским, и, как свидетельствовали современники, за все свое долговременное игуменство ни разу не нарушила этого правила. Церковные службы матушка посещала неопустительно, последний ее выход в церковь был за два дня до смерти. После смерти на ней нашли власяницу. Как настоятельница игумения Иоанна была строга. Принимая в обитель сестер, она брала с них подписку до смерти безвыходно пребывать в монастыре, не разрешала никаких поездок и отпусков на родину. Вела старческое окрмление и всемерно заботилась, дабы насельницы обители не проводили времени праздно. В то же время строгость настоятельницы в отношении духовного уклада монастырской жизни не была ни черствостью, ни жестокостью. К сестрам она была милостива, как мать, а они благоговели перед своей игуменией. По свидетельству епископа Арсения (Жадановского), «святое сродство» объединяло ее душу с душой известного старца Зосимовой пустыни схиигумена Германа (Гомзина), который «время от времени проведывал ее с целью поучиться монашеству и поутешиться беседою».
Перед революцией 1917 года Борисоглебская Аносинская обитель была процветающей. В ней подвизалось около 180 монахинь и послушниц, хозяйство было хорошо налажено, здесь производили почти все виды сельскохозяйственных работ, занимались вышивкой и другими рукоделиями.